菌液pcr非特异条带测序-搜答案-搜搜考试网

建议：循环次数减少3,Mg离子浓度降低到1.2mm,提高annealing的温度

如果实验目的只是基因型鉴定,对PCR产物无其他要求的话,二聚体并非不能忍受,可以尝试以下方法优化反应条件：1.确定DNA模板为阳性,即确定含有目标序列；2.对退火温度设置温度梯度,琼脂糖电泳检测是否有

存在两种可能性,第一,引物设计错误,可以将引物和参考序列进行拼接后看看能不能顺利拼接,以及拼接之后的目的片段长度；第二,可能是非特异扩增,这个时侯如果确定引物位置没有问题,可以调整退火温度,以及PCR

可能是水污染了,另外还有你操作及操作环境的原因.建议ddH2O灭菌后分装到2ml离心管放入-20°备用,每次用一管如果容易污染的话,建议你到超净台中操作PCR过程

DNA的双链主要是靠氢键联系在一起.退火温度越高,断开氢键的热能越大,引物与模板越不易结合,反之,退火温度越低,越容易形成氢键,进行退火.所以当温度高时,只有碱基匹配程度高的,也就是模板与引物形成配对

1.引物设计不够特异,检查你的序列,去BLAST看看.2.退火温度过低,检查你的引物的Tm,检查你的程序设置.

两者原因,可能是PCR体系没设计好,或者是胶没制好,跑电泳时注意保持电流恒定再问：多谢指教！跑电泳时我用的是恒功率，这个影响会很大吗？最近在做SSR标记有点迷茫！

如果PCR系统没有问题,很可能是质粒和染色体发生了重组.建议提细菌的genomeDNA做一次PCR.如果是阳性,就说明是这样.另外,还可以另挑几个菌落,重新提质粒扩增.

可以照胶的时候去调节亮度,对比和γ射线,然后会清楚一些.同时,你优化下PCR扩增条件之类的,提高扩增效率.希望对你有帮助.望采纳.再问：感谢回答，我会试试调节亮度。请问，这跟电泳时使用的染色液有关系吗

能确定菌液pcr出来的就是目的条带吗?如果确定,那就是可能质粒抽提和酶切这两步出了问题

菌落PCR的假阳性高很可能是因为你做PCR的循环数过大,我们实验室一般对于高拷贝数的质粒,循环数不会超过25个,一般用25个.我知道一家做这些,[威斯腾生物].感觉还可以

1.先看下PCR电泳图里杂带多不多,若有的话很可能非特异性扩增了2.若条带干净,仍然有可能存在非特异性扩增,引物特异性不高导致竞争结合可将DNA直接酶切看是否能切出你的目标片段3.序列比对结果不能只看

恐怕还是cDNA的问题,actin因为量比较丰富,所以即使破坏一些仍能P出来,但你的目的基因就不同了

出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带.非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2

非特异性条带的出现,其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体.二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数过多有关.其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一

你提高退火温度再来一次吧,1000+bp的产物怎么会在250-500bp里,

两个策略：1.提高退火温度；2.降低镁离子浓度.如果还不行就两个同时进行.

PCR扩增的结果和模板的质量有直接的关系,在PCR扩增中如果模板纯度高,很低的量都可以进行扩增的.提取细菌的DNA量不多但纯度高,即使DNA电泳检测不到条带,PCR仍然能扩出条带.希望你看明白了.

开始我以为是退火温度问题,但是你说做了两次,第一次没有条带,第二次有一条没有,这说明你加样有问题,还有你为什么要同一个cDNA要做六个PCR呢?还是lz说的不清楚?同样的条件同样的样品没理由会六条中只

1退火温度不合适2引物不合适3模板有问题4酶由问题