搜搜考试网测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢
来源：学生作业帮 编辑：搜搜考试网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/07/30 21:02:41
测序结果分析,以及RACE引物设计.求助呢
我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现各种不同物种的的该基因,其中与模式生物的该基因100%相似.abi图谱看起来也比较靠谱.我还要做什么呢?是不是可以直接用该基因设计引物准备做RACE扩增全长了?请设计过RACE3‘和5’端特异性引物帮忙指点一下.
另外我想说,我是一个小白,之前没什么实验基础.到现在拿到了保守区.从零基础一路以来,老师也没时间指导,都是靠自己在论坛里面提问.感谢那些帮助我的朋友.让我的实验如此的顺利.基本所有实验都一次性成功.一切尽在掌握中.谢谢
我的是用简并引物扩增的未知基因的高度保守区.现在已经拿到测序结果.我首先找到了上下游引物的位置,然后把质粒DNA截掉.拿高度保守区BLAST结果出现各种不同物种的的该基因,其中与模式生物的该基因100%相似.abi图谱看起来也比较靠谱.我还要做什么呢?是不是可以直接用该基因设计引物准备做RACE扩增全长了?请设计过RACE3‘和5’端特异性引物帮忙指点一下.
另外我想说,我是一个小白,之前没什么实验基础.到现在拿到了保守区.从零基础一路以来,老师也没时间指导,都是靠自己在论坛里面提问.感谢那些帮助我的朋友.让我的实验如此的顺利.基本所有实验都一次性成功.一切尽在掌握中.谢谢
先对实验对象进行诱导使你要的目的基因保证表达,然后提取总RNA,设计RACE特异性引物,5'RACE的特异性引物根据保守区靠近5‘端设计下游引物记得设计两条下游引物（模版序列的反向互补）,一条比另一条更靠近保守区的上游,这两条最好相距几个碱基,还要保证和RACE上游引物的TM值相近.先用总RNA为模板使用5‘RACE试剂盒处理RNA5’帽子随后进行反转录,然后利用RACE上游引物和你设计的靠保守区下游的下游引物进行第一轮PCR.产物作为模版以RACE上游引物和你设计的靠保守区上游的下游引物进行第二轮PCR,以第二轮PCR产物进行克隆测序.
3‘RACE的特异性引物根据保守区靠近3’端设计上游引物1条（照抄模版序列）要保证和RACE下游引物的TM接近,利用3'RACE试剂盒反转录总RNA,然后使用你设计的上游引物和RACE下游引物中的Outer进行第一轮PCR,产物作为模版以你设计的上游引物和RACE下游引物中的Inner进行第二轮PCR,以第二轮PCR产物进行克隆测序.
两轮PCR即巢式PCR,目的是更有效的避免非特异扩增,因为你模版用的是总RNA
再问： 做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同，5’RACE的GSP和NP引物为cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。 请问这是什么意思？3'race和5'race不应该都跟模版相同吗？有点困惑。谢谢指点。
再答： 这个我上面的答案其实还是说的不够细致，因为当时想当然的认为你是明白的。 你想咱们说的cDNA和mRNA是互补的吧，那么：3‘race第一步是反转录，那么你反转录后得到了cDNA第一链，我们自己设计的引物将来是要和这个第一链结合的，即这个第一链就是模版，记住3‘Race是说你不知道mRNA的3’端那段，即等于你不知道cDNA第一链的5‘端那段，由于反转录的时候我们用的反转录引物上有个已知序列的接头，所以得到的cDNA第一链的5’端最顶端那段序列我们是已知的（和接头的序列相同），以后的PCR的时候我们用到的3‘RACE引物就是和这段与接头序列相同的引物（暂且理解为相同，即照抄），而GSP（gene specific primer基因特异引物，就是自己设计的引物）引物则要和cDNA已知区段反向互补。 5’RACE按同理分析。 我第一给你的答案用了“上游引物”“下游引物”的概念，其实是不够科学的，因为在反转录和后续的PCR中模版角色在发生变化，上下游引物的概念就不一样了，但是我当时的意思是那个意思。
再问： 首先，真心非常感谢你的耐心解释。我这些都是 第一次做，有很多东西一知半解。现在状况是这样的。我已经拿到了保守区的测序结果。这个基因是未知的，我接下来准备做3'RACE 5' RACE扩增基因全长。就卡在设计3' 5' GSP引物这儿了。我想向您请教：我的3‘GSP应该跟测序结果3'端某处反向互补？5'端应高跟测序结果5'端某处相同，是吗？我开始以为都应该跟测序结果相同。还有两端的特异性引物都设计一个就行了吗？谢谢。中秋快乐
再答： 这样，你的5‘RACE 的GSP引物和3’RACE 的GSP引物都各设计两条，5‘RACE 的GSP引物按照mRNA的保守序列的靠5’端设计（和保守序列反向互补）；3‘RACE的GSP引物按照mRNA的保守序列的靠3’端设计（照抄保守序列）。你的测序结果和你做RACE用到的mRNA是相同的序列，都是编码链序列。 为啥说设计的时候要靠5‘端和3’端设计是为了将来测序的时候省钱，比如说你的保守序列长2000bp，称其为序列AB（A在5‘，B在3’），假设你mRNA3‘端为C，BC长为1000bp，如果你设计的3’RACE的GSP引物靠近A，你将来扩出的片段为AC长约3000，而如果你设计的3‘RACE的GSP引物靠近B，将来扩出的片段为BC长度约为1000bp，但你只想知道BC的序列就可以了，测序AC显然比测序BC要费钱。 3’RACE还是5‘RACE都各设计两条引物，是为了做巢式PCR，即第一轮用一对外侧引物PCR（一条你设计的靠外侧的GSP和一条试剂盒带的外侧引物），第二轮用内侧引物（一条你设计的靠内侧的GSP和一条试剂盒带的内侧引物）。
3‘RACE的特异性引物根据保守区靠近3’端设计上游引物1条（照抄模版序列）要保证和RACE下游引物的TM接近,利用3'RACE试剂盒反转录总RNA,然后使用你设计的上游引物和RACE下游引物中的Outer进行第一轮PCR,产物作为模版以你设计的上游引物和RACE下游引物中的Inner进行第二轮PCR,以第二轮PCR产物进行克隆测序.
两轮PCR即巢式PCR,目的是更有效的避免非特异扩增,因为你模版用的是总RNA
再问： 做RACE的引物与扩增已知序列的引物设计有所不同，5’RACE的GSP和NP引物为cDNA上的序列，3’RACE的GSP和NP引物为与cDNA反向互补的序列。 请问这是什么意思？3'race和5'race不应该都跟模版相同吗？有点困惑。谢谢指点。
再答： 这个我上面的答案其实还是说的不够细致，因为当时想当然的认为你是明白的。 你想咱们说的cDNA和mRNA是互补的吧，那么：3‘race第一步是反转录，那么你反转录后得到了cDNA第一链，我们自己设计的引物将来是要和这个第一链结合的，即这个第一链就是模版，记住3‘Race是说你不知道mRNA的3’端那段，即等于你不知道cDNA第一链的5‘端那段，由于反转录的时候我们用的反转录引物上有个已知序列的接头，所以得到的cDNA第一链的5’端最顶端那段序列我们是已知的（和接头的序列相同），以后的PCR的时候我们用到的3‘RACE引物就是和这段与接头序列相同的引物（暂且理解为相同，即照抄），而GSP（gene specific primer基因特异引物，就是自己设计的引物）引物则要和cDNA已知区段反向互补。 5’RACE按同理分析。 我第一给你的答案用了“上游引物”“下游引物”的概念，其实是不够科学的，因为在反转录和后续的PCR中模版角色在发生变化，上下游引物的概念就不一样了，但是我当时的意思是那个意思。
再问： 首先，真心非常感谢你的耐心解释。我这些都是 第一次做，有很多东西一知半解。现在状况是这样的。我已经拿到了保守区的测序结果。这个基因是未知的，我接下来准备做3'RACE 5' RACE扩增基因全长。就卡在设计3' 5' GSP引物这儿了。我想向您请教：我的3‘GSP应该跟测序结果3'端某处反向互补？5'端应高跟测序结果5'端某处相同，是吗？我开始以为都应该跟测序结果相同。还有两端的特异性引物都设计一个就行了吗？谢谢。中秋快乐
再答： 这样，你的5‘RACE 的GSP引物和3’RACE 的GSP引物都各设计两条，5‘RACE 的GSP引物按照mRNA的保守序列的靠5’端设计（和保守序列反向互补）；3‘RACE的GSP引物按照mRNA的保守序列的靠3’端设计（照抄保守序列）。你的测序结果和你做RACE用到的mRNA是相同的序列，都是编码链序列。 为啥说设计的时候要靠5‘端和3’端设计是为了将来测序的时候省钱，比如说你的保守序列长2000bp，称其为序列AB（A在5‘，B在3’），假设你mRNA3‘端为C，BC长为1000bp，如果你设计的3’RACE的GSP引物靠近A，你将来扩出的片段为AC长约3000，而如果你设计的3‘RACE的GSP引物靠近B，将来扩出的片段为BC长度约为1000bp，但你只想知道BC的序列就可以了，测序AC显然比测序BC要费钱。 3’RACE还是5‘RACE都各设计两条引物，是为了做巢式PCR，即第一轮用一对外侧引物PCR（一条你设计的靠外侧的GSP和一条试剂盒带的外侧引物），第二轮用内侧引物（一条你设计的靠内侧的GSP和一条试剂盒带的内侧引物）。