肝脏组织中atf2 基因cDNA的PCR程序
来源:学生作业帮 编辑:搜搜考试网作业帮 分类:生物作业 时间:2024/06/30 15:21:20
肝脏组织中atf2 基因cDNA的PCR程序
快纠结死我了,我用以下程序跑电泳出来的结果几乎总是弥散,看不到目的条带.
F:CCGAGATCTatgagtgatgacaaaccctttctat 有BGI2 酶切位点
G:CCGGTTAACtcaacttcctgagggctgtg 有HPA1 酶切位点
atf2基因,有两个isoform,一个1441bp,一个1321bp.
PCR程序如下:
94℃ 5min,
94℃ 30s,65℃30s,68℃2min,这里14个循环直至退火温度降到60℃,
接下来94℃30s,60℃35s,72℃2min,这里一共35个循环,
最后72℃10min.
哪里不对吗?
PCR是50uL体系,模板加了1ul
快纠结死我了,我用以下程序跑电泳出来的结果几乎总是弥散,看不到目的条带.
F:CCGAGATCTatgagtgatgacaaaccctttctat 有BGI2 酶切位点
G:CCGGTTAACtcaacttcctgagggctgtg 有HPA1 酶切位点
atf2基因,有两个isoform,一个1441bp,一个1321bp.
PCR程序如下:
94℃ 5min,
94℃ 30s,65℃30s,68℃2min,这里14个循环直至退火温度降到60℃,
接下来94℃30s,60℃35s,72℃2min,这里一共35个循环,
最后72℃10min.
哪里不对吗?
PCR是50uL体系,模板加了1ul
RNA提质量怎么样?CDNA模板浓度,引物浓度,退火温度都有比较大的影响,需要自己摸索
再问: 跟加样过程有关系吗?没有提过RNA。。
再答: 没有提RNA哪来的CDNA吖?退火温度是引物和模板结合的关键,不是有关系而是相当重要!还有才注意到你的目的基因很长,超过1KB的片段不容易出来的,要反复摸索条件
再问: 其实额是新手,cDNA模板是师姐提供的,上游引物TM68,下游引物TM72.。退火温度设置的是不是需要调高一些呢,如果做梯度PCR,可以设成60-68的梯度吗?
再答: 梯度可以试试,另外我觉得你的引物好长啊,目的基因也长,这样的情况本来就不容易P出来,再就是师姐的模板浓度够吗?这个也有影响
再问: 模板浓度好像有1.04多ug/uL
再答: 浓度可以。一般引物18-24bp是比较理想的,你的太长了,这样的话Tm值很高,退火温度都跟延伸温度一样了,所以反应条件还要再推敲。你确定引物合适吗?反正我没用过这么长的。多跟导师沟通改进方法,我们实验室摸索PCR条件连镁离子和taq酶浓度都要摸,所以别心急,一步一步早晚会出来的
再问: 跟加样过程有关系吗?没有提过RNA。。
再答: 没有提RNA哪来的CDNA吖?退火温度是引物和模板结合的关键,不是有关系而是相当重要!还有才注意到你的目的基因很长,超过1KB的片段不容易出来的,要反复摸索条件
再问: 其实额是新手,cDNA模板是师姐提供的,上游引物TM68,下游引物TM72.。退火温度设置的是不是需要调高一些呢,如果做梯度PCR,可以设成60-68的梯度吗?
再答: 梯度可以试试,另外我觉得你的引物好长啊,目的基因也长,这样的情况本来就不容易P出来,再就是师姐的模板浓度够吗?这个也有影响
再问: 模板浓度好像有1.04多ug/uL
再答: 浓度可以。一般引物18-24bp是比较理想的,你的太长了,这样的话Tm值很高,退火温度都跟延伸温度一样了,所以反应条件还要再推敲。你确定引物合适吗?反正我没用过这么长的。多跟导师沟通改进方法,我们实验室摸索PCR条件连镁离子和taq酶浓度都要摸,所以别心急,一步一步早晚会出来的
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