搜搜考试网3000bp的DNA如何分段设计引物
来源：学生作业帮 编辑：搜搜考试网作业帮 分类：生物作业 时间：2024/07/11 15:49:06
3000bp的DNA如何分段设计引物
我的基因全长是2821bp,我开始只是针对全长设计引物,我第一次神奇般的P出来了,可是以后再也没有P出来,我现在打算分段去P.可是我不知道该怎么样分?多少bp为一段,请高人指教,在此,先谢过了啊
我的基因全长是2821bp,我开始只是针对全长设计引物,我第一次神奇般的P出来了,可是以后再也没有P出来,我现在打算分段去P.可是我不知道该怎么样分?多少bp为一段,请高人指教,在此,先谢过了啊
就我的感觉来说,2800bp不算长了.4k多的PCR我们这边很多实验室也做过,没什么问题.针对全长设计引物是合理的做法,因为分段的话后续步骤更多一些,比如酶切链接纯化什么的,那么引起突变或者降解的可能性就大些.
“第一次P出来了”是个什么概念?是仅仅有条带,还是已经测序正确呢?如果是前者,还是要确定一下它是不是杂带；如果是后者,那么就可以以它为模版继续扩增了.
以个人的经验来说,长片段PCR结果不好,首先考虑换条件（退火温度?离子强度?）,其次考虑换酶（有的酶强些,有的酶弱些）,再次考虑模版（如果是cDNA模版,它的质量很关键）,再次考虑引物（软件并不是每次都可信,如果有文献报道过的最好）.作为一个并不算长的片段,分段是下策.
真的要分段,在中间找个酶切位点分成两段就好了,每段一千多,也就可以了.再多了实在没意义,后面还麻烦.注意这个酶切位点必须是在这2800bp中只有一个,而且在酶切位点前后设计引物比较容易.
比如说,EcoRI吧,那么P出来的结果是 5'- XXX.GAATTCXXX,和XXXGAATTCXX.XXX -3',然后酶切链接测序去吧.
“第一次P出来了”是个什么概念?是仅仅有条带,还是已经测序正确呢?如果是前者,还是要确定一下它是不是杂带；如果是后者,那么就可以以它为模版继续扩增了.
以个人的经验来说,长片段PCR结果不好,首先考虑换条件（退火温度?离子强度?）,其次考虑换酶（有的酶强些,有的酶弱些）,再次考虑模版（如果是cDNA模版,它的质量很关键）,再次考虑引物（软件并不是每次都可信,如果有文献报道过的最好）.作为一个并不算长的片段,分段是下策.
真的要分段,在中间找个酶切位点分成两段就好了,每段一千多,也就可以了.再多了实在没意义,后面还麻烦.注意这个酶切位点必须是在这2800bp中只有一个,而且在酶切位点前后设计引物比较容易.
比如说,EcoRI吧,那么P出来的结果是 5'- XXX.GAATTCXXX,和XXXGAATTCXX.XXX -3',然后酶切链接测序去吧.